ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ ΤΗΣ ΧΡΩΜΑΤΙΝΗΣ ΤΟΥ ΣΠΕΡΜΑΤΟΣ ΤΟΥ ΔΙΘΥΡΟΥ ΜΑΛΑΚΙΟΥ Ostrea edulis

Αγγελοπούλου B., Θ. Παταργιάς και Β. Αλεπόρου-Μαρίνου

Τομέας Γενετικής και Βιοτεχνολογίας, Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Αθηνών

Η πρωτεϊνική σύσταση του πυρήνα του σπέρματος όλων των δίθυρων μαλακίων παρουσιάζει κάποια κοινά χαρακτηριστικά:

·      Οι πρωτεϊνες του πυρήνα του σπέρματος συνιστούν ένα ετερογενές μίγμα απο ιστόνες και παρόμοιες με τις πρωταμίνες πρωτεϊνες που έχουν υψηλή περιεκτικότητα σε βασικά αμινοξέα και πολύ χαμηλή σε υδρόφοβα.

·      Οι ιστόνες είναι πάντα παρούσες στο σύνολό τους και η στοιχειομετρία τους είναι η ίδια, όπως εκείνη που παρατηρείται στη χρωματίνη των σωματικών κυττάρων, ενώ κατά την εξέλιξη της σπερματογένεσης οι ιστόνες ελαττώνονται σταδιακά.

·        O αριθμός των παρόμοιων με πρωταμίνες πρωτεϊνών ποικίλει στις διάφορες τάξεις και οικογένειες που έχουν μελετηθεί, όμως η χημική τους σύσταση είναι παρόμοια.

Η πρωτεϊνική ποικιλότητα που συναντάται σε αυτή την ταξινομική ομάδα μαλακίων πιθανότατα απεικονίζει τις διαφορετικές δομικές στρατηγικές που ακολούθησε η εξέλιξη για να επιτευχθεί η οργάνωση της χρωματίνης στο σπέρμα των οργανισμών αυτών. Η ανάλυση τέτοιων απλών συστημάτων πιστεύεται οτι μπορεί να αποτελέσει τη μοριακή βάση για την κατανόηση των πιο περίπλοκων. Ως ένα τέτοιο απλό σύστημα επιλέχθηκε στην παρούσα μελέτη το δίθυρο μαλάκιο Ostrea edulis .

Στο πρώτο μέρος της εργασίας απομονώθηκαν και καθαρίστηκαν οι ειδικές για το σπέρμα βασικές πρωτεϊνες απο ώριμες αρσενικές γονάδες. Με βάση την αμινοξική τους σύσταση έγινε διάκριση της παρόμοιας με την Η1 πρωτεϊνης απο εκείνη με χαρακτηριστικά πρωταμίνης. Η παρόμοια με την Η1 πρωτεϊνη (ΟΕΗ) αντιπροσωπεύεται με 2 παραλλαγές: τις ΟΕ1 και ΟΕ2. Ακολούθησε προσδιορισμός της πρωτοδιάταξης ενός μικρού τμήματος της πρωτεϊνης αυτής που προέκυψε μετά απο πέψη με BrCN και αντιστοιχεί στο καρβοξυτελικό άκρο της πρωτεϊνης.

Η σύγκριση της αλληλουχίας αυτής με την αλληλουχία της αντίστοιχης πρωτεϊνης (PL-ΙΙ*) απο το σπέρμα του δίθυρου μαλακίου Μytilus trossulus, έδειξε πολύ μεγάλη ομολογία (περίπου 90%).

Ενισχυτικά του αποτελέσματος αυτού είναι τα αποτελέσματα δύο άλλων πειραμάτων: αρχικά της ανοσοεντόπισης της ΟΕΗ με αντίσωμα ως προς την PL-II*, και στην συνέχεια της πέψης της ΟΕΗ με τρυψίνη, όπου προσδιορίστηκε η ύπαρξη ενός πυρήνα ανθεκτικού στο συγκεκριμένο ένζυμο, που είναι χαρακτηριστικός των παρόμοιων με την Η1 πρωτεϊνών των δίθυρων μαλακίων. Στο δεύτερο μέρος της εργασίας έγινε προσπάθεια να απομονωθεί το γονίδιο της ΟΕΗ απο cDNA βιβλιοθήκη που κατασκευάστηκε στο εργαστήριο μας απο mRNA άωρου σπέρματος Ostrea edulis. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε μήτρα DNA  απο τη βιβλιοθήκη και με τη χρήση τεχνικής PCR και εκκινητές τον Τ3 ή τον Τ7 και ένα ολιγονουκλεοτίδιο που κατασκευάστηκε με βάση τη γνωστή αμινοξική αλληλουχία απο το καρβοξυτελικό άκρο της πρωτεϊνης. Τα προϊόντα που προέκυψαν έχουν μέγεθος παρόμοιο με εκείνα που προκύπτουν όταν ως μήτρα στο PCR χρησιμοποιείται το γονίδιο της PL-II*. Στο τελικό στάδιο τα PCR προϊόντα υποκλωνοποιήθηκαν και βρέθηκε η πρωτοδιάταξή τους, που έδειξε μεγάλη ομολογία με την PL-II*.

ΧΡΗΣΗ ΤΟΥ ΜΥΚΗΤΑ Αspergillus nidulans ΓΙΑ ΤΗ ΛΕΙΤΟΥΡ-ΓΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΚΑΙ ΤΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ ΣΧΕΣΕΩΝ ΔΟΜΗΣ-ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ ΜΕΤΑΦΟΡΕΩΝ ΝΟΥΚΛΕΟΤΙΔΙΚΩΝ ΒΑΣΕΩΝ/ ΑΣΚΟΡΒΙΚΟΥ ΟΞΕΟΣ

Αργυρού Ε., Ζ. Ερπαπάζογλου, Α. Γιώτη, Γ. Διαλλινάς και Β. Σοφιανοπούλου

Ινστιτούτο Βιολογίας, Ε.ΚΕ.Φ.Ε. «Δημόκριτος», Αγία Παρασκευή, 15310, Αθήνα

Οι νουκλεοτιδικές βάσεις και το ασκορβικό οξύ εμπλέκονται σε πολλαπλές κυτταρικές λειτουργίες των προ- και ευκαρυωτικών οργανισμών. Όμως ελάχιστα είναι γνωστά για τους μοριακούς μηχανισμούς που είναι υπεύθυνοι για την κυτταρική πρόσληψη και ανακατανομή των μεταβολιτών αυτών. Επιπλέον, ο ταχύτατος ρυθμός καθορισμού γονιδιωμάτων από διαφορετικούς οργανισμούς που έχει οδηγήσει στην αναγνώριση νέων γονιδίων άγνωστης φυσιολογικής λειτουργίας κάνει επιτακτική την ανάγκη εύρεσης νέων πρότυπων οργανισμών για τη μελέτη των γονιδίων αυτών. Ο Aspergillus nidulans αποτελεί πρότυπο οργανισμό για τη μελέτη μεταφορέων νουκλεοτιδικών βάσεων καθώς έχει γίνει λεπτομερειακή μελέτη των ενδογενών μεταφορέων του (1). Οι μεταφορείς ουρικού οξέος και ξανθίνης του μύκητα ανήκουν σε μια μοναδική οικογένεια πρωτεϊνών που περιέχει ομόλογες πρωτεΐνες άγνωστης λειτουργίας από τα βακτήρια, τα παρασιτικά πρωτόζωα, τους μύκητες, τα φυτά, τα θηλαστικά και μεταφορείς ασκορβικού οξέος από τον άνθρωπο (2). Πρόσφατες μελέτες του εργαστηρίου μας οδήγησαν στο λειτουργικό χαρακτηρισμό ενός μεταφορέα ουρικού οξέος απαραίτητου για την ανάπτυξη των χλωρο-πλαστών στο καλαμπόκι με την έκφρασή του στον A. nidulans. (3). Στην παρούσα εργασία παρουσιάζουμε το λειτουργικό χαρακτηρισμό του προϊόντος του βακτηριακού γονιδίου yicE της Escherichia coli, την ετερόλογη έκφραση του ανθρώπινου μεταφορέα ασκορβικού οξέος στον A. nidulans και τον τρόπο προσέγγισης των σχέσεων δομής-λειτουργίας του μεταφορέα αυτού.

ΣΥΝΔΥΑΣΜΟΣ ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΩΝ ΕΠΙ ΤΟΥ 25S rRNA ΤΗΣ ΖΥΜΗΣ ΚΑΙ ΕΠΙ ΤΗΣ ΡΙΒΟΣΩΜΑΤΙΚΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ S23 ΜΕΤΑΒΑΛΛΕΙ ΤΗΝ ΠΙΣΤΟΤΗΤΑ ΤΗΣ ΜΕΤΑΦΡΑΣΗΣ ΚΑΙ ΤΗΝ ΣΥΝΘΕΣΗ ΠΟΛΥΦΑΙΝΥΛΑΛΑΝΙΝΗΣ

Βαμβακάς Σ., Ι. Δρέσιος και Δ. Συνετός

Εργ. Βιολογικής Χημείας, Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών, 26110 Πάτρα

Μεταλλάξεις στις ριβοσωματικές πρωτεΐνες και rRNA της ζύμης επι-δρούν στην πιστότητα της μετάφρασης. Έχουμε αποδείξει ότι η υποκατά-σταση Lys62àArg στη ριβοσωματική πρωτεΐνη S23 ελαττώνει την πιστό-τητα, ενώ η Lys62àAsn την αυξάνει. Και η 60S υπομονάδα ίσως ενέχεται στη ρύθμιση αυτή. Η κατασταλτική μετάλλαξη rdn5 στην περιοχή σαρκίνης /ρισίνης του 25S rRNA επέδρασε στην πρωτεϊνοσύνθεση και ελάττωσε την πιστότητα. Η μελέτη των rRNA μεταλλάξεων στα ευκαρυωτικά κατέστη δυνατή με τη χρήση ενός πλασμιδίου υψηλού αριθμού αντιγράφων που εκφράζει μια και μοναδική αλληλουχία rDNA που περιλαμβάνει τις ρυθμι-στικές και κωδικοποιούσες περιοχές των 18S, 5.8S, 5S και 25S rRNA.

Μετασχηματισμένα κύτταρα ζύμης φέροντα τις μετάλλαξεις rdn5 και Lys62àArg ή Lys62àAsn παρέμειναν βιώσιμα, αν και το νέο πλασμιδια-κό σύστημα μείωσε την έκταση της σύνθεσης πολυφαινυλαλανίνης στο 56% αυτής του αγρίου τύπου. Όμως η ταυτόχρονη παρουσία των rdn5 και Lys62àArg αύξησε την έκτασή της στο 92% αυτής του αγρίου τύπου.

Η πιστότητα της μετάφρασης ήταν στο κατώτατο επίπεδο στο στέλεχος που φέρει τις rdn5 και Lys62àArg. Η λανθασμένη ενσωμάτωση λευκίνης αυξήθηκε από το επίπεδο των 1,4 λαθών για το στέλεχος αγρίου τύπου στο επίπεδο των 10 λαθών ανά 1000 μεταφραζόμενα κωδίκια. Η λανθα-σμένη ενσωμάτωση λευκίνης του άλλου στελέχους που φέρει τις rdn5 και Lys62àAsn προσδιορίστηκε σε 4,5 λάθη ανά 1000 μεταφραζόμενα κωδί-κια. Και στις δυο περιπτώσεις, η αύξηση των λαθών ισούται προς το άθροισμα των μεταβολών που προκαλεί η κάθε μια μετάλλαξη.

Η μετάλλαξη rdn5, παρ’ ότι προκαλεί αύξηση των μεταφραστικών λαθών, εν τούτοις προσδίδει ανθεκτικότητα στην παρομομυκίνη, διαχωρίζο-ντας έτσι την διττή επίδραση αυτού του αντιβιοτικού α) στην πιστότητα της μετάφρασης και β) στην θανάτωση των κυττάρων. Ελέγχεται εάν αυτή η ιδιότητα της μετάλλαξης rdn5 μεταφέρεται σε κάποιο από τα διπλά μεταλλαγμένα στελέχη.

ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΕΣ ΣΥΝΕΠΕΙΕΣ ΤΗΣ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΗΣ ΤΗΣ ΣΠΕΡΜΙΝΗΣ ΜΕ ΟΡΙΣΜΕΝΕΣ ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ ΤΗΣ 50S-ΡΙΒΟΣΩΜΑΤΙΚΗΣ ΥΠΟΜΟΝΑΔΑΣ

Ξαπλαντέρη, Μ.¹, Αμάραντος, Ι.¹, Χολή-Παπαδοπούλου, Θ.²

και Δ. Λ. Καλπαξής¹

¹Εργαστήριο Βιολογικής Χημείας, Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών, 26500-Πάτρα. ²Εργαστήριο Βιοχημείας, Τμήμα Χημείας, Πανεπιστήμιο Θεσ/νίκης, 54006-Θεσ/νίκη

Ένα φωτοδραστικό ανάλογο της σπερμίνης, η Ν¹-βενζαμιδινο (ΑΒΑ)-σπερμίνη, συνετέθη με πρόσδεση μιας αρυλαζιδο-ομάδας σε μια από τις ακραίες αμινομάδες της σπερμίνης. Έλεγχος της βιολογικής δράσης του αναλόγου πιστοποίησε, ότι η ΑΒΑ-σπερμίνη διατηρεί όλες σχεδόν τις ιδιότητες της σπερμίνης. Κατόπιν τούτου, ΑΒΑ-[¹⁴C]σπερμίνη φωτο-ενσωματώθηκε  σ’ ένα λειτουργικό ριβοσωματικό σύμπλοκο, το AcPhe-tRNA·poly(U)·ριβόσωμα (σύμπλοκο C). Η κατανομή της ραδιενέργειας μεταξύ των πρωτεϊνών της 50S-ριβοσωματικής υπομονάδας, μετρήθηκε κάτω από πειραματικές συνθήκες ενεργοποίησης ή αναστολής της πεπτιδυλοτρανσφεράσης (PTase). Υπό συνθήκες ενεργοποίησης, οι πρωτεΐνες που επισημάνθηκαν εντονότερα ήσαν οι L2, L3, L4, L6, L15, L17 και L18 που εντοπίζονται πλησίον του καταλυτικού κέντρου της PTase. Υπό συνθήκες αναστολής, φωτοσημάνθηκαν κυρίως πρωτεΐνες (L1, L16, L19, L22, L23 και L27) που βρίσκονται μακρυά από το καταλυτικό κέντρο. Το γεγονός αυτό εισηγείται, ότι η επιλεκτική πρόσδεση των πολυαμινών σε ειδικές «πρωτεΐνες της PTase» έχει ευεργετικό αποτέλεσμα στις λειτουργικές ιδιότητες του συμπλόκου C. Με σκοπό την περαιτέρω διερεύνηση του φαινομένου, το αμινοξύ Glu-56 της L4, στο οποίο πιθανώς προσδένεται η σπερμίνη, αντικαταστάθηκε από αλανίνη. Ριβοσώματα που έφεραν τη μεταλλαγμένη πρωτεΐνη L4 είχαν μειωμένη δραστικότητα, μη επιδεχόμενη βελτίωσης από σπερμίνη. Αντίθετα, μεταλλαγή της Glu-56 σε ασπαραγινικό δεν προκάλεσε  σημαντική αλλαγή στη δραστικότητα της PTase, η οποία διατήρησε την ιδιότητά της να διεγείρεται από σπερμίνη.

Ευχαριστήρια αναφορά: Η εργασία εκπονήθηκε στα πλαίσια προγράμματος (99ΕΔ605) που έχει επιχορηγηθεί από την Γ.Γ.Ε.Τ του Υπουργείου Ανάπτυξης και το Κοινοτικό Ταμείο Στήριξης.

ΠΡΟΘΥΜΟΣΙΝΗ-α ΚΑΙ ΠΑΡΑΘΥΜΟΣΙΝΗ : Η ΣΥΜΜΕΤΟΧΗ ΤΟΥΣ ΣΤΗ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ ΚΑΙ ΣΤΟΝ ΑΝΑΔΙΠΛΑΣΙΑΣΜΟ

ΤΟΥ DNA

Βαρέλη Κ., Τσόλας Ο., Φράγκου – Λαζαρίδη Μ.

Εργ. Βιολογικής Χημείας Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου Ιωαννίνων, 45110 Ιωάννινα

Η προθυμοσίνη α (MW 12000) και η παραθυμοσίνη (MW 11000) συν-απομονώθηκαν με την συνθετική ιστόνη H1 και την μη ιστονική πρωτείνη HMG17από όξινα θερμοάντοχα πρωτεϊνικά εκχυλίσματα θύμου αδένα. Οι δύο πρωτείνες κωδικοποιούνται από γονίδια 5 εξονίων, η κάθε μία, που εδράζονται στα χρωματοσώματα 2 και 17 αντίστοιχα. Η ομοιότητα της πρωτοταγούς δομής και των ιδιοτήτων των πρωτεϊνών και ιδιαίτερα το γεγονός ότι εμφανίζουν συμπληρωματική ιστική κατανομή θεωρήθηκε ένδειξη πιθανής ομοιότητας στην λειτουργία ή ότι παρέχει τη δυνατότητα ανταλλαγής ρόλων μεταξύ των δύο πρωτεϊνών. Μελέτες συνεστιακής μικροσκοπίας απεκάλυψαν ότι οι δύο πρωτείνες σχετίζονται με διαφο-ρετικές πυρηνικές λειτουργίες. Η προθυμοσίνη α συγκεντρώνεται σε μεταγραφικά ενεργείς πυρηνικές περιοχές ενώ η παραθυμοσίνη εμφανίζεται στις αρχικές θέσεις αναδιπλασιασμού του DNA.

Στις μελέτες αυτές προσδιορίστηκαν επίσης δύο πρωτεϊνες πιθανοί συνεργάτες για την προθυμοσίνη α. Η πρωτεϊνη της προμυελωματικής λευχαιμίας (PML) και η κύρια πυρηνική πρωτείνη της ωρίμανσης του 3΄ άκρου του  RNA GstF64 (1). Στην παρούσα μελέτη παρουσιάζουμε αποτελέσματα που εμφανίζουν ανακατανομή της προθυμοσίνης α στην μίτωση ή στις περιπτώσεις ιικών μολύνσεων. Στην μίτωση η πρωτείνη συγκεντρώνεται στα δύο κεντροσωμάτια και συνεντοπίζεται με την τουμπουλίνη α, στις θέσεις εστιασμού της κυκλίνης Β. Επίσης, στις περιπτώσεις ιικής μόλυνσης HeLa κυττάρων με Adeno 5 η πρωτεϊνη αλλάζει κατανομή δίνοντας διαμόρφωσεις σε σχήμα δακτυλίου οι οποίες δεν περιέχουν PML. Η παραθυμοσίνη εμφανίζει πάντοτε μία στικτή πυρηνική εικόνα. Θεωρούμε ότι οι παρατηρήσεις μας αποτελούν έναυσμα για τη βιοχημική ανάλυση του ογκογονικού δυναμικού της προθυμοσίνης σε RAT-1 κύτταρα (2). Παρόμοιος ρόλος δεν έχει προταθεί για την παραθυμοσίνη.

1. Vareli et al.(2000) Exp. Cell. Res. 257,152-161

2. Orre et al. (2000) J. Biol. Chem.(in press)

Η ΣΗΜΕΙΑΚΗ μεταλλαγή F569S μετατρέπει το μετα-φορέα ουρικού οξέος-ξανθίνης (UapA) του A.nidulans

σε υψηλής απόδοσης γενικό μεταφορέα νουκλεοτιδικων βασεων

Κουκάκη Μ., Αμίλλης Σ και Γ. Διαλλινάς 

Εργαστήριο Μικροβιολογίας, Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Αθηνών, Αθήνα 15784, Ελλάδα

Το UapA είναι ένας υψηλής απόδοσης μεταφορέας  ουρικού οξέος-ξανθίνης του ασκομύκητα Aspergillus nidulans. To UapA ανήκει σε μια μεγάλη οικογένεια μεταφορέων νουκλεοβάσεων-ασκορβικού συντηρημένων σε βακτήρια, αρχαία, μύκητες, φυτά και μετάζωα. Από προηγούμενες μελέτες σχέσεων δομής-λειτουργίας του UapA έχουν αναγνωριστεί συγκεκριμένα αμινοξέα (E412, E414, Q449, N450, T457), τα οποία είναι σημαντικά για την δέσμευση ή και μεταφορά πουρινών. Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκε το κρυοευαίσθητο στέλεχος UapA-Q449E το οποίο δεν προσλαμβάνει ουρικό οξύ και ξανθίνη στους 25^οC, για να επιλεχθούν κατασταλτικές μεταλλαγές που επαναπροσδίδουν στην πρωτεΐνη UapA την ικανότητα μεταφοράς ουρικού οξέος. Από τις 10 κατασταλτικές μεταλλαγές που επιλέxτηκαν, οι 7 φάνηκε να απόκτησαν την ιδιότητα να μεταφέρουν νέα υποστρώματα, όπως υποξανθίνη, αδενίνη και ουρακίλη. Μετά από χαρτογράφηση των μεταλλαγών αυτών βρέθηκε, ότι όλα φέρουν τη μεταλλαγή F569S, που εντοπίζεται στο τελευταίο διαμεμβρανικό τμήμα (TMS14) της πρωτεΐνης. Περαιτέρω αναλύσεις κινητικής έδειξαν ότι το στέλεχος UapA-Q449E/F569S είναι σε θέση να μεταφέρει με υψηλή συγγένεια (Km_S 4-15μΜ) ξανθίνη, υποξανθίνη και ουρακίλη. Πειράματα ανταγωνισμού πρόσληψης πουρινών έδειξαν επιπλέον ότι το νέο αυτό στέλεχος μεταφέρει και άλλες πουρίνες (ουρικό οξύ, αδενίνη, γουανίνη), καθώς και νουκλεοσίδια ή φάρμακα ανάλογα νουκλεοβάσεων (5-φθοροουρακίλη, 6-θειογουανίνη). Επιπλέον, στέλεχος που φέρει μόνο την καινούρια μεταλλαγή (F569S), φάνηκε να διατηρεί την ικανότητα να μεταφέρει όλα τα υποστρώματα που μεταφέρονται από το στέλεχος UapA-Q449E/F569S, αλλά με αυξημένη συγγένεια για ξανθίνη κατά 7 φορές και μειωμένη συγγένεια για υποξανθίνη κατά 5 φορές. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι αμινοξέα εκτός της κεντρικής λειτουργικής μονάδας της πρωτεΐνης (L9-TMS10-L10) είναι σημαντικά για την κινητική και εξειδίκευση του μεταφορέα UapA. Γνωρίζοντας τη σημασία των πουρινών και πυριμιδινών για την ιατρική και φαρμακολογία, τα παραπάνω αποτελέσματα αναμένεται να αποδειχτούν χρήσιμα σε μελέτες που θα αφορούν την εξειδικευμένη μεταφορά ανάλογων φαρμάκων σε συγκεκριμένους στόχους. 

φωτομετρικη ΜΕΘΟΔΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟy ΤΗΣ θειολικησ ΟΞΕΙΔΟΑΝΑΓΩΓΙΚΗΣ ΚΑΤΑΣΤΑΣΗΣ των οργανισμων

Νικόλαος Πατσούκης και Χρήστος Δ. Γεωργίου

Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Πατρών

Η θειολική οξειδοαναγωγική κατάσταση είναι ένας πολύ σημαντικός δείκτης της οξειδωτικής πίεσης των αερόβιων οργανισμών. Αναπτύξαμε μια μη ενζυμική μέθοδο για τον προσδιορισμό των πιο σημαντικών συστατικών της κατάστασης αυτής σε μύκητες, φυτά και ζώα. H μέθοδος μετρά τα συστατικά αναγμένη γλουταθειόνη (GSH), οξειδωμένη γλουταθειόνη (GSSG), πρωτεϊνικά δισουλφίδια γλουταθειόνης (PSSG), πρωτεΐνες με SH ομάδες (PSH) και πρωτεΐνες με δισουλφιδικές γέφυρες (PSSP). Η φωτομετρική μέθοδος βασίζεται στην αναγωγή του 5,5’-dithiobis-(nitrobenzoic acid) από SH ομάδες και παραγωγή του χρωμοφόρου 2-nitro-5-mercaptobenzoic acid που απορροφά μέγιστα στα 412 nm. Τα συστατικά της θειολικής οξειδοαναγωγικής κατάστασης προσδιορίστηκαν ως μείγματα μετά από κατάλληλη κυτταρική κλασμάτωση (πέντε κλάσματα), ακολουθούμενη από χημική αναγωγή ορισμένων κλασμάτων με ΝαΒΗ₄ και διαλυτοποίηση με ουρία. Το πρώτο κλάσμα εξετάστηκε για GSH και PSH, το δεύτερο εξετάστηκε για GSH, PSH, PSSG και PSSP, το τρίτο εξετάστηκε για GSH, το τέταρτο εξετάστηκε για PSH, PSSG και PSSP και το πέμπτο εξετάστηκε για PSH, PSH από PSSP και PSH από PSSG. Τα δεδομένα από τα κλάσματα συνδυάστηκαν με δεδομένα από κατάλληλα πειράματα με εσωτερικούς και εξωτερικούς μάρτυρες  (με καθαρή GSH και GSSG) και χρησιμοποιήθηκαν για την εγξαγωγή εξισώσεων με τις οποίες προσδιορίζονται όλα τα επιμέρους συστατικά και τα σταθερά τους σφάλματα. Η αξιοπιστία της μεθόδου επιβεβαιώθηκε με τον προσδιορισμό των GSΗ και GSSG σε όργανα ποντικού και την σύγκρισή τους με τις αντίστοιχες τιμές που αναφέρονται στη διεθνή βιβλιογραφία, οι οποίες είχαν υπολογιστεί με ενζυμικές μεθόδους. Η μέθοδος μπορεί να εφαρμοστεί σε όλους τους οργανισμούς ύστερα από ελάχιστες τροποποιήσεις.

θειολικη ΟΞΕΙΔΟΑΝΑΓΩΓΙΚΗ ΚΑΤΑΣΤΑΣΗ ΚΑΙ ΔΙΑΦΟ-ΡΟΠΟΙΗΣΗ: ΣΚΛΗΡΩΤΙΑΚΗ ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ

ΜΥΚΗΤΑ Sclerotium rolfsii

Νικόλαος Πατσούκης και Χρήστος Δ. Γεωργίου

Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Πατρών

Διερευνήσαμε το ρόλο της κυτταρικής θειολικής οξειδοαναγωγικής κατά-στασης στη διαφοροποίηση, με μοντέλο τη διαφοροποίηση (σκληρωτιακή) του φυτοπαθογόνου μύκητα Sclerotium rolfsii. Eιδικότερα, μελετήσαμε πώς συγκεκριμένα συστατικά της κατάστασης αυτής [αναγμένη γλουταθειόνη (GSH), οξειδωμένη γλουταθειόνη (GSSG), πρωτεϊνικά δισουλφίδια γλουταθειόνης (PSSG), πρωτεΐνες με SH ομάδες (PSH) και πρωτεΐνες με δισουλφιδικές γέφυρες (PSSP)] σχετίζονται με τη σκληρωτιακή διαφοροποίηση και με τους δείκτες οξειδωτικής πίεσης υπεροξειδωμένα λιπίδια και πρωτεΐνες παρουσία του πρόδρομου μορίου της GSH N-acetylcysteine. Μετρήσαμε τα συστατικά της θειολικής οξειδοαναγωγικής κατάστασης κατά το αδιαφοροποίητο και διαφοροποιημένο στάδιο μιας διαφοροποιούμενης αποικίας του S. rolfsii υπό συνθήκες υψηλής και χαμηλής οξειδωτικής πίεσης, με μάρτυρα μια μη διαφοροποιούμενη αποικία υπό υψηλή οξειδωτική πίεση. Γενικά, τα επίπεδα των αναγμένων σουλφυδρυλικών συστατικών GSH και PSH κατά το αδιαφοροποίητο στάδιο της διαφοροποιούμενης αποικίας είναι υψηλότερα από τα οξειδωμένα συστατικά GSSG, PSSG, και PSSP. H κατάσταση αυτή αντιστρέφεται στο διαφοροποιημένο στάδιο. Οι δείκτες οξειδωτικής πίεσης GSSG/GSH, PSSG/GSH και PSSP/PSH διατηρούνται πολύ χαμηλότεροι στις μη διαφοροποιούμενες αποικίες, συγκρινόμενοι με ισοδύναμες σε ηλικία και ξηρό βάρος αποικίες του διαφοροποιούμενου μύκητα κατά τη μετάβασή του στο διαφοροποιημένο στάδιο. H εξωγενής N-acetylcysteine προκάλεσε δοσοεξαρτώμενη αύξηση της GSH, συνοδευόμενη από επίσης δοσοεξαρτώμενη ελάττωση της διαφοροποίησης (μέχρι και πλήρη αναστολή της) και της υπεροξείδωσης των πρωτεϊνών και των λιπιδίων. Τα δεδομένα αυτής της μελέτης επιβεβαιώνουν τη θεωρία μας για τη σκληρωτιακή διαφοροποίηση, που προτείνει ότι επάγεται από την οξειδωτική πίεση και αναστέλλεται από αντιοξειδωτές (όπως η GSH στην προκείμενη μελέτη).