16:30 – 18:30

6η ΣΥΝΕΔΡΙΑ ΠΑΡΑΛΛΗΛΗ

Αίθουσα «Θεάτρου» (Ισόγειο)

Προεδρείο: Δ. Αλεξανδράκη, Ε. Ζούρος

16:30 – 17:00

Ζούρος Ε.

Τμήμα Bιολογίας. ΠΚ και Ινστιτούτο Θαλάσσιας Bιολογίας Κρήτης

TO IΔIOPPYΘMO ΣYΣTHMA TOY MITOXONΔPIAKOY DNA TΩN EIΔΩN THΣ OIKOΓENEIAΣ MYTILIDAE

17:00 – 17:15

Λαδουκάκης1 Ε.Δ. και Ε. Ζούρος1,2

1Τμήμα Βιολογίας, ΠΚ.  2Ινστιτούτο Θαλάσσιας Βιολογίας, Κρήτης, Ηράκλειο.

Ανασυνδυασμός στο μιτοχονδριακό DNA των ζώων

17:15 – 17:30

Μίζη Α., Κ. Βενέτης και Γ. Κ. Ροδάκης

Τομέας Βιοχημείας και Μοριακής Βιολογίας, Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ

ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΩΝ ΔΙΑΚΡΙΤΩΝ ΤΥΠΩΝ ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΑΚΟΥ DNA ΤΟΥ ΕΙΔΟΥΣ Mytilus galloprovinciallis ΚΑΙ ΠΡΩΤΑ ΒΗΜΑΤΑ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΤΗΣ ΠΡΩΤΟΔΙΑΤΑΞΗΣ ΤΟΥ ΤΥΠΟΥ ΤΗΣ ΣΠΕΡΜΑΤΙΚΗΣ ΓΡΑΜΜΗΣ

17:30 – 17:45

Μπελετσιώτης Ε.Α, Γ. Οικονόμου και Μ.Α.Τύπας

Τομέας Γενετικής και Βιοτεχνολογίας, Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ

ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΚΑΙ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ uvrA, uvrB ΚΑΙ uvrD ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΤΟΥ ΣΤΕΛΕΧΟΥΣ CP4 ΤΟΥ ΑΙΘΑΝΟΛΟΠΑΡΑΓΩΓΟΥ ΒΑΚΤΗΡΙΟΥ Zymomonas mobilis

17:45 – 18:00

Γκίκας Δ. Β. και Μ Α. Τύπας

Τμήμα Βιολογίας, Σχολή Θετικών Επιστημών, ΕΚΠΑ

Προσδιορισμός και λειτουργική ανάλυση του μιτοχονδριακού γονιδιώματος του εντομοπαθογόνου μύκητα Metarhizium anisopliae

18:00 – 18:15

Πάντου M., Α. Μαυρίδου και Μ. Α. Τύπας

Τομέας Γενετικής και Βιοτεχνολογίας, Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ

ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΠΥΡΗΝΙΚΗΣ ΡΙΒΟΣΩΜΙΚΗΣ DNA ΕΠΑΝΑΛΗΨΗΣ ΤΟΥ ΕΝΤΟΜΟΠΑΘΟΓΟΝΟΥ ΜΥΚΗΤΑ Metarhizium anisopliae

18:15 – 18:30

Γραμμενούδη1 Σ, Γ. Βένδρα2, Γ. Χριστοπούλου2,

Γ. Γιαννόπουλος2 και Σ. Γ. Τσιτήλου1

1Τομέας Βιοχημείας και Μοριακής Βιολογίας, Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ. 2Τομέας Γενετικής, Βιολογίας Κυττάρου και Ανάπτυξης, Τμήμα Βιολογίας, ΠΠ

ΜΟΡΙΑΚΗ ΚΑΙ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ GnT II ΤΗΣ Drosophila melanogaster

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


 TO IΔIOPPYΘMO ΣYΣTHMA TOY ΜITOXONΔPIAKOY DNA TΩN EIΔΩN THΣ OIKOΓENEIAΣ MYTILIDAE

E. Ζούρος

Τμήμα Bιολογίας Παν/μίου. Κρήτης & Ινστιτούτο Θαλάσσιας Bιολογίας Κρήτης

Οι γενετικές πληροφορίες των ευκαρυωτικών οργανισμών εδράζονται στο DNA του πυρήνα και στο DNA των κυτταροπλασματικών οργανιδίων. Μια σημαντική διαφορά μεταξύ των δυο ειδών DNA είναι ότι το πυρηνικό μεταβιβάζεται διγονικά ή μονογονικά, ενώ το κυτταροπλασματικό μεταβιβάζεται πάντοτε μονογονικά (1). Εξαίρεση στον κανόνα αποτελεί η κληρονόμηση του μιτοχονδριακού DNA (mtDNA) σε είδη της οικογένειας Mytilidae (μύδια). Στα είδη αυτά συνυπάρχουν δύο τύποι mtDNA. O ένας τύπος (F) μεταβιβάζεται από την μητέρα σε όλους τους απογόνους ανεξαρτήτως φύλου, ενώ ο άλλος, (M), μεταβιβάζεται από τον πατέρα μόνο στους γιους (8, 9, 13, 14). Από τη σκοπιά του αρσενικού ατόμου η κληρονό-μηση του mtDNA είναι αμφιγονική (διγονική), όμως, από τη σκοπιά του mtDNA η μεταβίβαση είναι μονογονική, αφού κάθε τύπος μορίου μεταβιβάζεται μέσω ενός μόνο φύλου. Για το λόγο αυτό το φαινόμενο ονομάσθηκε διπλή μονογονική κληρο-νομικότητα (ΔMK) (14). O κατάλογος που ακολουθεί περιλαμβάνει τις πιο βασικές πληροφορίες που έχουμε μέχρι σήμερα σχετικά με το φαινόμενο της ΔMK.

α) Tα θηλυκά άτομα κληρονομούν mtDNA μόνο από τη μητέρα τους, ενώ τα αρσενικά και από τους δυο γονείς.

β) H μητέρα μεταβιβάζει το mtDNA της και στα δύο φύλα, ενώ ο πατέρας μεταβι-βάζει το (πατρικής προέλευσης) mtDNA μόνο στους γιους.

γ) Tα μιτοχόνδρια του σπέρματος εισέρχονται σ’ όλα τα ωάρια, αλλά εξαφανί-ζονται μέσα στις πρώτες 24 ώρες μετά την γονιμοποίηση στα ωάρια που θα αναπτυχθούν σε θηλυκούς απογόνους (12).

δ) Τα αρσενικά άτομα είναι ετεροπλασμικά μωσαϊκά: Οι σωματικοί ιστοί περι-έχουν κυρίως το μητρικό mtDNA, ενώ η γονάδα τους, το πατρικό mtDNA (12).

ε) Επειδή τα δύο μιτοχονδριακά γονιδιώματα ακολουθούν διαφορετικούς δρόμους μεταβίβασης, εξελίσσονται ανεξάρτητα το ένα από το άλλο. H μέση απόκλιση μεταξύ τους στην αλληλουχία του DNA είναι πάνω από 20%, ανάλογη με την απόκλιση του mtDNA ειδών που ανήκουν σε διαφορετικές τάξεις (6, 10).

 

στ) Tο M γονιδίωμα φαίνεται ότι εξελίσσεται με ταχύτερο ρυθμό, ίσως γιατί «ξεφεύγει» από την αυστηρή επίβλεψη της φυσικής επιλογής (11).

ζ) Σποραδικά, ένα F μόριο μπορεί να εισέλθει στην γραμμή μεταβίβασης του M μορίου. Αυτά τα «αρρενοποιημένα» F μόρια μοιάζουν μοριακά με τα γνήσια F και κληρονομικά με τα γνήσια M (3, 4).

η) Τα Unionidae (μύδια των χερσαίων υδάτων) αποτελούν τη μόνη άλλη γνωστή οικογένεια οργανισμών που εμφανίζει το φαινόμενο της ΔMK (5).

θ) Σε είδη της οικογένειας Mytilidae η αναλογία φύλου σε διασταυρώσεις ενός θηλυκού με ένα αρσενικό κυμαίνεται από σχεδόν 0 αρσενικά μέχρι 85% αρσενικά. Κάθε θηλυκός γονέας έχει μια χαρακτηριστική αναλογία φύλου, που δεν επηρεάζεται από το αρσενικό που γονιμοποιεί τα ωάριά του (7).

ι) Αυτή η ιδιότητα του θηλυκού γονέα δεν εξαρτάται από το mtDNA του (αδημοσίευτα αποτελέσματα).

Tα δύο τελευταία σημεία θέτουν το θέμα της σύνδεσης της κληρονόμησης του mtDNA με τον φυλοκαθορισμό στο μύδι, για τον οποίο ξέρουμε μόνο ότι το φύλο παραμένει σταθερό και ότι η αναλογία φύλων είναι 1:1 στους φυσικούς πληθυσμούς. Oι Saavedra, Reyero και Zouros (7) πρότειναν μια σχέση αιτίου-αιτιατού μεταξύ της κληρονόμησης των mtDNA και του φύλου. Δεν υπάρχουν άμεσες αποδείξεις του μοντέλου αυτού, πέρα από το γεγονός ότι είναι συμβατό με όλες τις διαθέσιμες παρατηρήσεις. Tο μοντέλο ξεκινά με την υπόθεση ότι η ΔMK αποτελεί τροποποίηση της κοινής μητρικής κληρονόμησης του mtDNA, όπου τα μιτοχόνδρια του σπέρματος απαλείφονται από το γονιμοποιημένο ωάριο μέσω ενός συστήματος αναγνώρισης ενός παράγοντος που εδράζεται στην εξωτερική επιφάνεια των σπερματικών μιτοχονδρίων από ένα παράγοντα του κυτταροπλάσματος του ωού. Στο μύδι προτείνεται η ύπαρξη ενός τρίτου παράγοντα που ελέγχεται από ένα πυρηνικό τόπο με ένα ενεργό και ένα ανενεργό αλληλόμορφο. Tο προϊόν του ενεργού αλληλομόρφου παρεμβαίνει στην διαδικασία της αναγνώρισης των μιτοχονδρίων του σπέρματος, με αποτέλεσμα τα σπερματικά μιτοχόνδρια να παραμένουν στο γονιμοποιημένο ωάριο. H παρουσία αυτή προκαλεί την αρρενοποίηση του εμβρύου. Θηλυκά με τον παράγοντα παράγουν κυρίως γιους, ενώ θηλυκά χωρίς το παράγοντα παράγουν κυρίως κόρες. H εμπλοκή ενός μιτοχονδριακού παράγοντα στον φυλοκαθορισμό θα αποτελέσει, αν αποδειχθεί, μια ακόμη περίπτωση στον αυξανόμενο κατάλογο περίεργων μηχανισμών καθορισμού του φύλου.

 

 

Oι πιο σημαντικές ερωτήσεις για τον μηχανισμό της ΔMK παραμένουν αναπάντητες και μπορούν να συνοψισθούν ως εξής:

 

α)      Ποιός είναι ο μηχανισμός απάλειψης του mtDNA του σπέρματος από ωάρια που πρόκειται να δώσουν θηλυκά άτομα;

β)      Eίναι δυνατή η παρακολούθηση της τύχης των σπερματικών μιτοχονδρίων (ή του σπερματικού mtDNA) στα έμβρυα που πρόκειται να δώσουν αρσενικά άτομα;

γ)       Eίναι  δυνατή η παρέμβαση στον καθορισμό του φύλου, είτε με την καταστροφή των μιτοχονδρίων του σπέρματος (παραγωγή θηλυκών απογόνων από μητέρες που παράγουν γυιούς), είτε με την παρεμπό-διση της απομάκρυνσης των μιτοχονδρίων (παραγωγή αρσενικών απογόνων από μητέρες που παράγουν κόρες);

δ)      Ποιός είναι ο μοριακός μηχανισμός καταστολής της αναγνώρισης των σπερματικών μιτοχονδρίων από τους παράγοντες του ωαρίου στα είδη με ΔMK;

ε)       Mε ποιό μηχανισμό η παρουσία των σπερματικών μιτοχονδρίων (ή του σπερματικού mtDNA) προκαλεί την αρρενοποίηση του εμβρύου;

στ)     Mια άλλη κατηγορία ερωτήσεων αφορά στην  εξέλιξη και διάδοση της ΔMK, στο ρόλο της ΔMK στην διαφοροποίηση των πληθυσμών, στις αλληλεπιδράσεις μεταξύ πυρηνικού DNA και mtDNA, στην ειδογένεση, κλπ.

 

Aνεξάρτητα από το κατά πόσο η ΔMK είναι διαδεδομένη στο ζωϊκό βασίλειο, το φαινόμενο αποτελεί μία τόσο βασική και εντυπωσιακή παραβίαση ενός γενικού κανόνα της βιολογίας που η μελέτη του δεν μπορεί παρά να οδηγήσει σε μία βαθύτερη κατανόηση της πολυπλοκότητας που κρύβεται πίσω από την εξέλιξη του mtDNA και τις αλληλεπιδράσεις του με το DNA του πυρήνα.


ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΟΣ ΣΤΟ ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΑΚΟ DNA ΤΩΝ ΖΩΩΝ

 

Ε. Δ. Λαδουκάκης1 και Ε. Ζούρος1,2

1Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Κρήτης, 2Ινστιτούτο Θαλάσσιας Βιολογίας Κρήτης, Ηράκλειο

 

Παρουσιάζουμε στοιχεία για την ύπαρξη ανασυνδυασμού στο mtDNA των ζώων από δύο διαφορετικές πηγές: δεδομένα από αλληλουχίες που βρέθηκαν στις γονάδες αρσενικών ατόμων μυδιών και δεδομένα που ανακτήθηκαν από ήδη δημοσιευμένες αλληλουχίες.

α) Τα αρσενικά άτομα του μυδιού κληρονομούν ένα τύπο mtDNA από τη μητέρα τους (F γονιδίωμα) και ένα από τον πατέρα τους (Μ γονιδίωμα). Στην πλειονότητα των περιπτώσεων τα δύο μόρια διαφέρουν κατά περισσότερο από 20% στη νουκλεοτιδική τους αλληλουχία, όμως περιστασιακά το πατρικό μιτοχονδριακό γονιδίωμα μπορεί να διαφέρει ελάχιστα από το μητρικό. Εξετάσαμε αρσενικά άτομα από την τελευταία κατηγορία και βρήκαμε ανασυνδυασμένες αλληλουχίες σε τέσσερα από τα δέκα άτομα. Οι ιστοί της γονάδας αυτών των ατόμων ήταν πολυπλασμικοί και όχι διπλασμικοί κυρίως εξαιτίας του ανασυνδυασμού. Μέσα στο κομμάτι των 681 ζ.β. από το γονίδιο της COIII, το μήκος των τμημάτων που είχαν ανταλλαχθεί μέσω του ανασυνδυασμού κυμαίνονταν από 24 έως 255 ζ.β. (ή και περισσότερο). Η πιθανότητα τα ανασυνδυασμένα αυτά μόρια να οφείλονται σε λάθος της μεθόδου αποκλείστηκε από δύο ανεξάρτητα πειράματα.

β) Διενεργήσαμε μια μη-συστηματική έρευνα στη βιβλιογραφία για να βρούμε στοιχεία για «ιστορικό ανασυνδυασμό». Πρώτα μετατρέψαμε τις νουκλεοτιδικές αλληλουχίες σε αμινοξικές με το σκεπτικό ότι το «σήμα» του ανασυνδυασμού θα είναι περισσότερο συντηρημένο στα αμινοξέα από ότι στα νουκλεοτίδια. Ανακαλύψαμε τρεις περιπτώσεις (μια στο καρκινοειδές Gammarus fossarum, στο γένος του αμφιβίου Rana, και στο γένος του θηλαστικού Apodemus) στις οποίες οι συγκρίσεις των αμινοξικών αλληλουχιών υποδείκνυαν την ύπαρξη ανασυνδυασμού. Στη συνέχεια επιστρέψαμε στις νουκλεοτιδικές αλληλουχίες και εξετάσαμε αν οι ομοιότητες μεταξύ των πιθανών ανασυνδυασμένων τμημάτων μπορούν να εξηγηθούν από τυχαία γεγονότα. Αυτή η πιθανότητα είναι εξαιρετικά μικρή.

Οι δύο παρατηρήσεις σε συνδυασμό δίδουν ισχυρές ενδείξεις για την ύπαρξη ανασυνδυασμού στο mtDNA των ζώων.


 ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΩΝ ΔΙΑΚΡΙΤΩΝ ΤΥΠΩΝ ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΑΚΟΥ DNA ΤΟΥ ΕΙΔΟΥΣ Mytilus galloprovinciallis ΚΑΙ ΠΡΩΤΑ ΒΗΜΑΤΑ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΤΗΣ ΠΡΩΤΟΔΙΑΤΑΞΗΣ ΤΟΥ ΤΥΠΟΥ ΤΗΣ ΣΠΕΡΜΑΤΙΚΗΣ ΓΡΑΜΜΗΣ

Μίζη Α., Κ. Βενέτης και Γ.Κ. Ροδάκης

Τομέας Βιοχημείας και Μοριακής Βιολογίας, Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Αθηνών, Πανεπιστημιούπολη, 157 01 Αθήνα.

Αντικείμενο της εργασίας αποτελεί η διερεύνηση του φαινομένου της διπλής μονογονικής κληρονομικότητας του μιτοχονδριακού DNA (mtDNA) του γένους Mytilus (μύδι). Στο γένος αυτό συνυπάρχουν δύο τύποι μορίων mtDNA, από τους οποίους ο πρώτος μεταβιβάζεται από τη μητέρα και στα δύο φύλα των απογόνων (τύπος-F), ενώ ο δεύτερος κληρονομείται από τη σπερματική γραμμή (τύπος-Μ), δηλαδή, από «πατέρα» σε «γιο». Η διερεύνηση αυτού του ανορθόδοξου φαινομένου προϋποθέτει τη δυνατότητα παρακολούθησης του πατρικής προέλευσης mtDNA κατά την οντογένεση με διάφορες μεθόδους (π.χ. υβριδοποιήσεις in situ) οι οποίες στο σύνολό τους βασίζονται στη δυνατότητα χρησιμοποίησης ειδικών F και M ανιχνευτών. Έτσι, με βάση την αλληλουχία των έστω λίγων, μέχρι σήμερα, γνωστών περιοχών του Μ-τύπου, σχεδιάστηκαν δύο ζεύγη ολιγονουκλεοτιδίων-εκκινητών, τα οποία αντιστοιχούν σε τμήμα της περιοχή άγνωστης λειτουργίας του F- και Μ-mtDNA. Η συγκριτική ανάλυση αλληλουχιών που προέκυψαν από τη χρήση αυτών των εκκινητών σε αντιδράσεις PCR, επιβεβαίωσε την ειδικότητά τους. Όμως, κατά την πορεία αυτών των πειραμάτων προέκυψαν ορισμένα «μη αναμενόμενα» αποτελέσματα. Συγκεκριμένα, αποδείχθηκε ότι τα περισσότερα από τα θηλυκά άτομα που εξετάστηκαν ήταν ετεροπλασμικά ως προς την περιοχή άγνωστης λειτουργίας, αλλά ομοπλασμικά ως προς μια περιοχή του γονιδίου του l-rRNA. To αποτέλεσμα αυτό μπορεί να εξηγηθεί με την παραδοχή ανασυνδυασμού μεταξύ Μ και F μορίων, αλλά η επιβεβαίωσή του προϋποθέτει τον έλεγχο περισσότερων ή πιο εκτεταμένων περιοχών του μορίου, γεγονός που υποδεικνύει την ανάγκη προσδιορισμού της πλήρους (ει δυνατόν) αλληλουχίας του Μ-mtDNA. Στην εργασία αυτή παρουσιάζονται οι πρώτες προσπάθειες προς αυτή την κατεύθυνση, δηλαδή, ο σχεδιασμός κατάλληλων ολιγονουκλεοτιδίων για αντιδράσεις «long PCR», όπως και ο προσδιορισμός της πρωτοδιάταξης επιλεγμένων περιοχών.

Η έρευνα αυτή χρηματοδοτείται από την Γ.Γ.Ε.Τ (ΠΕΝΕΔ99, Κ.Ε. 99ΕΔ120) και από τον Ειδικό Λογαριασμό του Πανεπιστημίου Αθηνών.


ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΚΑΙ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ uvrA, uvrB ΚΑΙ uvrD ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΤΟΥ ΣΤΕΛΕΧΟΥΣ CP4 ΤΟΥ ΑΙΘΑΝΟΛΟΠΑΡΑΓΩ-ΓΟΥ ΒΑΚΤΗΡΙΟΥ Zymomonas mobilis

 

Μπελετσιώτης Ε.Α, Γ. Οικονόμου και Μ.Α.Τύπας

 

Τομέας Γενετικής και Βιοτεχνολογίας, Τμήμα Βιολογίας, Σχολή Θετικών Επιστημών, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών,

Πανεπιστημιούπολη, 15784

 

To Zymomonas mobilis, είναι ένα αρνητικό κατά Gram βακτήριο μεγάλης βιοτεχνολογικής σημασίας λόγω του υψηλού ποσοστού αιθανόλης που παράγει κατά τη ζύμωση σακχάρων. Μέσω μιας γονιδιακής τράπεζας του οργανισμού απομονώθηκαν και αλληλουχήθηκαν τα uvrA, uvrB και uvrD γονίδια που είναι υπεύθυνα για τη σύνθεση των εξονουκλεασών Α και Β και της ελικάσης ΙΙ αντίστοιχα. Οι αλληλουχήσεις των γονιδίων αποκάλυψαν ένα ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης κατά περίπτωση μήκους 2841 bp, 2175 bp και 2199 bp. Αυτά κωδικοποιούν πιθανές πρωτεΐνες  αποτελούμενες από 946, 724 και 732 αμινοξικά κατάλοιπα αντίστοιχα. Οι πρωτεΐνες δείχνουν υψηλό βαθμό ομολογίας με αντίστοιχες πρωτεΐνες άλλων βακτηρίων. Ειδικά περιοχές που σχετίζονται με το ενεργό κέντρο έχουν παραμείνει συντηρημένες.  Τα γονίδια μεταφέρθηκαν στις αντίστοιχες Escherichia coli μεταλλαγές TK603, AB1886 και ES245 και εξετάστηκαν για συμπληρωματικότητα στη βιοσιμότητα σε υπεριώδη ακτινοβολία και στο χημικό μεταλλαξογόνο MMS. Το zmuvrA έδειξε μερική αναπλήρωση, το zmuvrB δεν έδειξε αναπλήρωση ενώ το zmuvrD αναπλήρωσε πλήρως το EcuvrD γονίδιο. To zmuvrB μεταφέρθηκε στο Z.mobilis στέλεχος uvs51 και αναπλήρωσε εντελώς την ευαισθησία του σε υπεριώδη ακτινοβολία, χαρακτηρίζοντάς το ως uvrB μεταλλαγή. Στις 5’ αμετάφραστες περιοχές των γονιδίων δεν υπήρχε εμφανής SOS ρυθμιστική αλληλουχία. Πειράματα Northern dot blot έδειξαν ότι τα γονίδια δεν επάγονται σε καταστάσεις που βλάπτεται το DNA του κυττάρου αλλά μεταγράφονται με ένα σταθερό ρυθμό και επομένως δεν υπάρχει SOS τύπου ρύθμιση.

 

 


 ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΠΥΡΗΝΙΚΗΣ ΡΙΒΟΣΩΜΙΚΗΣ DNA ΕΠΑΝΑΛΗΨΗΣ ΤΟΥ ΕΝΤΟΜΟΠΑΘΟΓΟΝΟΥ ΜΥΚΗΤΑ Metarhizium anisopliae

 

Πάντου M., Α. Μαυρίδου και Μ. Α. Τύπας

Τομέας Γενετικής και Βιοτεχνολογίας, Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Αθηνών, Πανεπιστημιούπολη, 15784 Αθήνα

 

Η πυρηνική rDNA περιοχή του στελέχους ΜΕ1 του μύκητα M. anisopliae απομονώθηκε και χαρακτηρίστηκε. Η μονάδα επανάληψης έχει μήκος 8.118 ζεύγη βάσεων και εμφανίζει τυπική ευκαρυωτική οργάνωση καθώς κωδικοποιεί για ένα μετάγραφο το οποίο περιλαμβάνει τα 18S, 5.8S και 28S rRNA γονίδια. Η αλληλουχία του 5S γονιδίου δεν εντοπίζεται στην μονάδα επανάληψης. Συγκρίσεις αλληλουχιών των κωδικών περιοχών με τις αντίστοιχες διαθέσιμες από άλλους μύκητες δείχνουν ότι οι πιο συγγενικές αλληλουχίες ανήκουν σε εντομοπαθογόνους μύκητες όπως Beauveria brongniartii, Cordyceps militaris, Cordyceps sp, Paecilomyces tenuipes. Για την ανίχνευση πολυμορφισμών ανάμεσα σε 44 στελέχη M. anisopliae var. anisopliae απομονωμένα από διαφορετικούς ξενιστές και γεωγραφικές περιοχές, χρησιμοποιήθηκαν ενδο-ειδικά εκκινητικά ολιγονουκλεοτίδια ικανά να ενισχύσουν τις περιοχές των γονιδίων 18S, 28S και 5.8S, καθώς και τις ITS1-5.8S-ITS2 και IGS περιοχές. Σε δύο στελέχη (9601 και V234)  πιστοποιήθηκε σε συγκεκριμένες θέσεις στην  28S περιοχή η παρουσία τριών group-I εσωνίων, που εμφάνιζαν όλες τις χαρακτηριστικές δομές της αντίστοιχης ομάδας εσωνίων. Ένα τέταρτο group-I εσώνιο αναγνωρίσθηκε στη 18S περιοχή τριών στελεχών (V216, V234, ITALY 11). Έμφαση δόθηκε στο πιο πολυμορφικό τμήμα της IGS περιοχής, δηλαδή στα πρώτα 1.032 ζεύγη βάσεων μετά το 28S γονίδιο, στο οποίο αποκαλύφθηκε η ύπαρξη μοτίβων χαρακτηριστικών για το είδος. Προσδιορίσθηκε από 19 στελέχη η πρωτοταγής δομή PCR προϊόντων αυτής της περιοχής, τα οποία εμφάνιζαν διαφορά στο μέγεθος σε σχέση με το στέλεχος μάρτυρα ΜΕ1. Η σύγκριση των εισδοχών, ελλείψεων και σημειακών αντικαταστάσεων στα 19 στελέχη επέτρεψε την ταξινόμησή τους σε τρεις διακριτές ομάδες. Μόνο μια χαλαρή συσχέτιση των ξενιστών των στελεχών και των ομάδων που δημιουργήθηκαν παρατηρήθηκε, ενώ δεν υπήρξε συσχέτιση των γεωγρα-φικών περιοχών προέλευσης των στελεχών και των ομάδων αυτών.


 


ΜΟΡΙΑΚΗ ΚΑΙ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ GnT II ΤΗΣ Drosophila melanogaster

Γραμμενούδη Σοφία1, Γεωργία Βένδρα2, Γεωργία Χριστοπούλου2, Γιώργος Γιαννόπουλος2 και Σόνια Γ. Τσιτήλου1

1Πανεπιστήμιο Αθηνών, Τμήμα Βιολογίας, Τομέας Βιοχημείας και Μοριακής Βιολογίας. 2Πανεπιστήμιο Πατρών, Τμήμα Βιολογίας, Τομέας Γενετικής, Βιολογίας Κυττάρου και Ανάπτυξης.

Η ακετυλογλυκοσαμινοτρανσφεράση ΙΙ, GnT II, είναι ένζυμο του συστή-ματος Golgi, υπεύθυνο για τη βιοσύνθεση των σύνθετων Ν γλυκανών. Είναι γνωστό ότι δύο σημειακές μεταλλαγές στο γονίδιο της GnT II στον άνθρωπο έχουν σοβαρές επιπτώσεις στην ανάπτυξη του νευρικού συστήματος και προκαλούν το σύνδρομο της ανεπάρκειας των υδαταν-θρακικών ομάδων των γλυκοπρωτεϊνών τύπου ΙΙ (Carbohydrate Deficient Glycoprotein Syndrome Type II). O νουκλεοτιδικός προσδιορισμός ενός cDNA κλώνου που απομονώθηκε από μια cDNA βιβλιοθήκη του εγκεφάλου της Drosophila melanogaster έδειξε ότι το γονίδιο GnT II της Drosophila περιέχει οχτώ (8) εξώνια σε αντίθεση με το ανθρώπινο γονίδιο που έχει ένα μόνο εξώνιο. Ο cDNA κλώνος φαίνεται ότι κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη μεγαλύτερη από τις αντίστοιχες του ανθρώπου και του αρουραίου. Η ανάλυση κατά Southern έδειξε ότι το γονίδιο είναι μοναδικό. Ανάλυση ολικού RNA (Northern) αποκάλυψε την ύπαρξη δύο βασικών προϊόντων μεταγραφής που παρουσιάζουν ποσοτικές διαφορές στα βασικά αναπτυξιακά στάδια. Ο cDNA κλώνος που αρχικά απομονώθηκε φαίνεται ότι αντιστοιχεί στο μεγαλύτερου μήκους mRNA, ενώ η ανάλυση του μικρότερου RNA έδειξε ότι αποτελεί προϊόν εναλλακτικής ωρίμανσης. In situ υβριδοποίηση σε έμβρυα και προνύμφες έδειξε ότι το γονίδιο εκφράζεται κυρίως στον εγκέφαλο. In situ υβριδοποίηση σε πολυταινικά χρωμοσώματα σιελογόνων αδένων αποκάλυψε ότι το γονίδιο της GnT II χαρτογραφείται στη θέση 99D του τρίτου χρωμoσώματος. Δημιουργία ελλειμμάτων στο γονίδιο μέσω  της ανώμαλης αποκοπής μιας P ένθεσης έδειξε ότι αυτά είναι θανατογόνα, γεγονός που υποδηλώνει τη σπουδαιό-τητα του γονιδίου στην επιβίωση του οργανισμού.

 


Προσδιορισμός και λειτουργική ανάλυση του μιτοχονδριακού γονιδιώματος του εντομο-παθογόνου μύκητα Metarhizium anisopliae

Γκίκας Δ. Β. και Μ Α. Τύπας

Τμήμα Βιολογίας, Σχολή Θετικών Επιστημών, Πανεπιστήμιο Αθηνών. Πανεπιστημιούπολη, Αθήνα, 15784

Ο μύκητας Μ. anisopliae var. anisopliae παρασιτεί σε ένα μεγάλο εύρος εντόμων. Αυτή η ιδιότητά του τον κάνει ένα σημαντικό εργαλείο σαν βιολογικό παράγοντα ελέγχου. Όπως για τους περισσότερους αφυλετικούς  μύκητες ελάχιστα είναι γνωστά για την βασική γενετική ή/και γονιδιακή οργάνωση  του οργανισμού. Για την εύρεση πολυμορφισμού εντός του είδους έχουν χρησιμοποιηθεί μια σειρά μοριακών τεχνικών μεταξύ των οποίων είναι η μελέτη του μιτοχονδριακού γονιδιώματος. Με την χρήση εκκινητικών ολογονουκλεοτιδίων που έχουν σχεδιαστεί σε συντηρητικές γονιδιακές περιοχές, ενισχύθηκε, με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης μεγάλου μήκους (Long Expand PCR), ολόκληρο το μιτοχονδριακό γονιδίωμα του οργανισμού. Ακολούθησε ο προσδιορισμός της λειτουργικής οργάνωσης καθώς και η εύρεση της πρωτοταγής του δομής. Τα συνολικό μέγεθος είναι 25500 bp, και βρίσκεται στην ίδια κλίμακα μεγέθους με μιτοχονδριακά γονιδιώματα άλλων εντομοπαθογόνων μυκήτων του γένους Verticillium, Beauveria και Paecilomyces. Στο μιτοχονδριακό γονιδίωμα προσδιορίστηκε η ύπαρξη 14 γονιδίων που κωδικοποιούν για αντίστοιχο αριθμό λειτουργικών πρωτεϊνών καθώς και 2 γονιδίων που κωδικοποιούν για τα RNAs της μικρής (SSU) και μεγάλης  ριβοσωμικής (LSU) υπομονάδας. Το γονιδίωμα είναι αρκετά συμπαγές, χωρίς πολλά εσώνια. H γονιδιακή του οργάνωση παρουσιάζει ομοιότητα με αντίστοιχη άλλων εντομοπαθογόνων μυκήτων αλλά διαφορές με αυτή φυτοπαθογόνων γενών όπως Podospora, Aspergillus κ.α.